本发明涉及甘蔗中草甘膦及其代谢物的定量检测，提出一种甘蔗中草甘膦及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，其包括步骤：(1)制备标准溶液并进行高效液相色谱串联质谱检测，得不同浓度的混合标准溶液的标准谱图；(2)将步骤1获得的标准谱图按草甘膦及其代谢物品种分别制作浓度与色谱峰面积关系曲线图；(3)甘蔗样品的预处理及高效液相色谱串联质谱检测；(4)样品中的草甘膦及其代谢物的含量的确定，将步骤3中获得的样品谱图的保留时间确定草甘膦及其代谢物品种并将其色谱峰面积与步骤2中得到的标准曲线比对，用插入法确定草甘膦及其代谢物含量。采用本发明具有前处理过程简单，检测速度快，检测结果准确、灵敏度高的特点。