本发明公开了一种免疫层析试纸条恒温孵育器及孵育方法，属于检测仪器技术领域。所述孵育器包括温度控制器和孵育底座；其中，温度控制器包括：电路板，设于温度控制器内部；加热片，与孵育底座的底部连接，同时还与电路板连接；温度传感器，设于温度控制器内部并与电路板连接；孵育底座包括：第一导热模块，设于所述温度控制器上方并与加热片相接触，第一导热模块上设置有加湿槽和孔状孵育槽；第二导热模块，设于所述第一导热模块上方并与第一导热模块固定连接；第二导热模块上设置有条型孵育槽；挡板，活动设置于第一导热模块与第二导热模块之间。本发明能够同时控制试纸条的温度及整体反应环境的湿度，提高检测结果的稳定性。