本发明公开了一种抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法及其应用。公开该抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体及其重链可变区和轻链可变区的DNA序列和氨基酸序列。设计了所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体的制备方法。将所述的抗HPV16 L1蛋白单克隆抗体在免疫学检测、抗原或抗体检测试剂盒中应用。该抗HPV16 L1蛋白的单克隆抗体能够特异性识别HPV16这一主要的流行亚型，与HPV16假病毒以及HPV16 L1蛋白都具有良好的反应性，与其他亚型的L1蛋白没有交叉反应。为进一步改造其抗体可变区序列制备不同组合形式的基因工程抗体和进行HPV不同亚型病原的临床检测研究奠定了良好的基础。