本发明属于蛹虫草栽培技术领域，公开了一种蛹虫草高活性菌种选育方法利用人工分离蛹虫草单孢子菌种，采用分子生物学方法区分蛹虫草基因交配型；通过筛选高产虫草素、腺苷等活性物质的单孢子菌种；经过营养亲和性筛选，选出一对不同基因交配型菌种配对进一步通过出草验证获得高产目标菌株。本发明改变了传统的通过改变培养基配方和简单的交配型配对的菌种选育技术，配对出草验证，突破了育种工作无量化考察参数的技术瓶颈，该发明可用于蛹虫草退化菌株的复壮也可应用于高活性菌种的选育，摆脱了传统育种方式的盲目和无序性，对于蛹虫草工厂化生产稳定产量、抑制菌种退化、针对已退化菌种进行复壮、选育高活性菌种具有重要意义。