本发明提供了一种3D大脑类器官的制备方法，包括：将RONA法获得的神经球经accutase消化为单细胞，计数后接种于细胞培养板上在培养基A中培养，培养至第7天后在培养基B中继续培养，培养至第25～35天时，Matrigel包裹神经球后继续培养至55～65天，第二次Matrigel包裹神经球后继续培养。本发明还提供了一种用于培养3D大脑类器官的培养基。本发明从RONA方法得到的高度纯化的神经球开始，用较为简单的方法可以控制并培养得到大小及结构均一的真正的3D大脑类器官，其具有大脑的六层皮层结构和抑制性中间神经细胞各亚型，适用于体外疾病研究、药物筛选等，具有重大的产业化的意义。