本发明属于生物工程领域，公开了一种酶法催化合成单甘酯的方法，具体是将甘油与脂肪酸按摩尔比为1:0.1～1:1进行混合，以固定化单甘酯脂肪酶作为催化剂，在温度为40‑70℃、搅拌速度为200～600rpm的条件下反应，利用真空泵不断除去反应过程中产生的水分，最后通过离心分离，得到单甘酯产物。本发明采用单甘酯脂肪酶作为催化剂酯化合成不饱和脂肪酸甘油单酯，反应的过程中不产生其他甘油酯副产物，简化单甘酯产物分离成本，同时具有减少能耗和环境友好，反应条件温和，转化效率高，产物纯度高，酶活损失少等优点，适合大规模推广应用。