本发明提供了一种去氢表雄酮的制备方法，包括：在保护气氛下，向叔丁醇中加入叔丁醇钾，搅拌均匀后加入4‑雄烯二酮得到混合料，将所述混合料滴加至含有抗坏血酸钠的乙酸溶液中反应得到5‑雄烯二酮；将所述5‑雄烯二酮溶于有机溶剂中，并添加酮还原酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和氧化还原辅酶得到混合液，控制所述混合液的pH为6.0‑6.3，于22‑26℃下搅拌反应1‑6小时后得到反应液，将所述反应液分离提纯后得到去氢表雄酮，所述酮还原酶和所述葡萄糖脱氢酶由微生物菌株共表达产生并以粗酶液形式添加。该制备方法合成工艺步骤少，操作简单，产率高，成本低，可以广泛适用于工业化规模生产。本发明还提供了一种制备用酶。