本发明涉及医学免疫学中荧光免疫层析技术领域，具体地说是一种人心肌肌钙蛋白I/肌红蛋白/肌酸激酶同工酶三合一测定试剂盒及制法，设有试纸卡，其特征在于所述试纸卡由下至上依次设有：PVC板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中结合垫上吸附有稀土Eu3+荧光微球标记的抗人心肌肌钙蛋白I、抗肌红蛋白、抗肌酸激酶同工酶三种单克隆抗体‑微球偶联复合物，所述稀土荧光微球的直径为150nm，稀土荧光微球含稀土镧系元素Eu3+，在基态下稳定，在337nm激发光源作用下发射出波长615nm的荧光：所述单克隆抗体为纯化后混合的单克隆抗体，分别来源于针对2‑6个不同人心肌肌钙蛋白I、肌红蛋白、肌酸激酶同工酶等抗原表位的单克隆抗体细胞株。具有操作简便、反应快速、灵敏度高、特异性强等优点。