本发明公开了一种制备酰基‑酰基载体蛋白的方法。以脂肪酸盐和酰基载体蛋白为底物，使用添加MgCl2，Li2SO4，三磷酸腺苷，二硫苏糖醇的Tris‑HCl缓冲液，以来源于Vibrioharveyi的脂酰‑ACP合成酶催化下，制备C4‑C18链长酰基‑酰基载体蛋白，尤其突破了长链酰基‑酰基载体蛋白规模制备产率低的瓶颈，实现了高转化率的长链(C16‑C18)酰基‑酰基载体蛋白的规模化合成。本发明所合成的酰基‑酰基载体蛋白可作为多种酶的反应底物，在生物工程领域具有显著的应用前景。