本发明涉及分子生物学技术领域，尤其一种适用于无缝克隆的嵌合酶的制备方法，本发明将噬菌体T7 5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶进行混合，实现无缝克隆，为进一步增强反应体系重复性和降低生产成本，将噬菌体T7 5’‑3’单链外切酶和T4 DNA多聚酶进行进行融合表达，构建成嵌合蛋白，在大肠杆菌进行表达和纯化。该融合蛋白更适合于无缝克隆体系，应用效果好，成本低，更适合产业化，在酶作用后的体系中添加脱氧核糖核苷三磷酸，可进一步提高克隆效率。