本发明涉及一种聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法与应用，所述聚乙二醇在ADI的1或2个亚基的N端氨基上偶联，所述聚乙二醇分子量为30‑40kDa，聚乙二醇为分支型。本发明提供的聚乙二醇定点修饰的ADI，在具有结构稳定均一等优点的基础上，更大程度的提高了其生物活性。并且，本发明所采用的ADI为基因工程重组表达得到，质量更可控，来源更有保障。这些都使得本发明中的聚乙二醇定点修饰的ADI各方面效果优于目前市场上同类产品，因此本发明的聚乙二醇定点修饰的ADI更具有药用前景及产业化生产可能性。