本发明涉及PEG修饰蛋白多关键参数同时检测的方法，本发明基于蛋白在紫外下的UV吸收值和在示差下的RI吸收值均与蛋白浓度呈线性关系；PEG在紫外下无吸收，而其RI吸收值同样与其浓度呈线性关系；PEG修饰后蛋白的PEG部分与蛋白部分互不干扰各自在UV或RI中的吸收值的原理,依据上述原理，本方法可同时进行了包括纯度、蛋白浓度、PEG结合数和游离PEG的四项关键指标的检测。本发明方法适用于不同的蛋白类型及不同PEG修饰剂类型的PEG修饰蛋白，本方法高效便捷、准确度高、操作简单，尤其针对聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶进行了检测方法的优化及验证，使得该方法在重复性、精密度等方面都满足了药品级检测要求。