一种基于方骨和上颌齿顶的大壁虎脑立体定位装置及方法，属脑立体定位技术领域。本发明装置利用大壁虎耳道方骨特殊的内凹结构，设计了与方骨结构相适应的耳杆端部，确保了大壁虎颅骨夹持的左右水平和对中；再通过上颌支撑板对其上颌齿顶的定位夹持，将大壁虎头部完全固定。本发明装置，由左右耳杆夹持器、壁虎适配器、三维电极移动装置等组成。独特的耳杆及其端部结构设计，配合上颌支撑板对大壁虎上颌齿顶的定位，使得大壁虎发生嘴部开闭，以及躯体剧烈动作时，其顶骨和额骨不再发生相对转动，确保了大壁虎脑组织在实验中的标准位置，不仅定位更加牢固可靠，而且具有定位准确、操作简单的特点。本方法也适合其他壁虎科动物的定位夹持。