本发明公开了一种荧光寿命估计方法、装置及存储介质，方法包括：获取荧光分子的衰减信息；根据荧光分子的衰减信息，建立基于荧光寿命和衰减信息的荧光寿命损失函数；以最小化荧光寿命损失函数为优化目标，建立约束优化模型；基于约束优化模型和荧光分子的衰减信息最小化所述荧光寿命损失函数，得到荧光分子的荧光寿命。本发明根据荧光分子的衰减信息建立荧光寿命损失函数，以最小化荧光寿命损失函数为优化目标建立约束优化模型，基于约束优化模型和衰减信息利用交替下降条件梯度算法最小化荧光寿命损失函数估计荧光寿命，估计方法受采集时间和光子数影响较小，在相同条件下可以大幅减小采集时间，提高荧光寿命成像速度。