本发明公开了一种溶瘤腺病毒的构建方法，包括以下步骤：步骤一：在NCBI数据库中调取HumanmastadenovirusC全基因组序列信息和Tert‑p启动子序列，根据Tert‑p、E1A、E1B及的E1A和E1B之间的链接区域(FBLink)序列信息，在通用生物系统(安徽)有限公司进行化学合成至PUC57载体，得到PUC57‑Tert‑E1A‑FBLink‑E1B质粒；步骤二：设计引物对PUC57‑Tert‑E1A‑FBLink‑E1B质粒进行扩增；步骤三：腺病毒载体经SacII酶切；步骤四：同源重组法构建FV012‑Tert‑E1A‑FBLink‑E1B溶瘤腺病毒载体；步骤五：将步骤四得到的载体和腺病毒骨架质粒PBHG转染到细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒。本发明获得的溶瘤腺病毒的复制能力和杀肿瘤细胞的能力要强于TERT‑E1A‑IRES‑E1B结构的溶瘤腺病毒。