一种基于全反射的显微物镜数值孔径测量方法及系统，涉及光学领域，尤其涉及测量液浸及固浸显微物镜数值孔径。它为了解决目前测量液浸及固浸显微物镜数值孔径操作繁琐，测量准确度不够高等问题。所述方法包括：光束从液浸或固浸显微物镜入射后聚焦在标准样片上，反射光在后焦面上形成带有全反射吸收弧的图谱，全反射吸收弧为圆形。通过计算图谱上全反射吸收弧的位置及半径，可测量出液浸或固浸显微物镜的数值孔径。所述装置使用照明光源发出光束，通过液浸或固浸显微物镜聚焦在标准样片上，反射光经过显微物镜出射，在探测器上成像，获得后焦面的像。本发明通过图像探测和识别，能够实现液浸或固浸显微物镜数值孔径的高精度测量。