本申请涉及一种显微成像中的焦平面确定方法及装置，属于计算机技术领域，该方法包括：获取在观察样本的指定区域中n个样本位置分别对应的n个实际焦点位置；基于n个实际焦点位置确定指定区域对应的局部焦平面；基于多个指定区域对应的局部焦平面构成观察样本对应的整体焦平面，该观察样本为多个指定区域的并集；可以解决使用观察样本上至少3个位置对应的焦点位置确定焦平面时，若观察样本表面不平整得到的焦平面不准确的问题；基于观察样本中多个指定区域对应的局部焦平面构成整体焦平面，而不是直接确定整体焦平面，可以提高观察样本表面不平整对应的焦平面的准确性。