本发明涉及一种基于柯勒照明的单像素显微成像系统及方法，该系统包括从左至右沿同一光轴线依次设置的激光光源、分光计、扩束镜、准直透镜、第一光阑、起偏器、数字微镜、检偏器、柯勒镜、第二光阑、第三光阑、聚光镜、精密控制载物台、会聚透镜以及光电探测器，所述显微成像系统还包括计算机，所述计算机与所述数字微镜、所述精密控制载物台以及所述光电探测器电性连接，所述计算机用于控制所述数字微镜、所述精密控制载物台以及所述光电探测器。本发明提出的基于柯勒照明的单像素显微成像系统，可提高成像系统的鲁棒特性、灵敏度及分辨率。