本发明公开了一种基于光场显微系统的三维显微成像方法及系统，其中，该方法包括：S1，在光学系统中，获取三维样本从物面到主相机传感器平面的第一点扩散函数和从物面到次相机传感器平面的第二点扩散函数，根据第一点扩散函数和第二点扩散函数生成第一前向投影矩阵和第二前向投影矩阵；S2，获取三维样本在光学系统中的主相机拍摄的光场强度图像和次相机拍摄的高分辨率强度图像；S3，通过预设算法对光场强度图像和第一前向投影矩阵、高分辨率强度图像和第二前向投影矩阵进行三维重建，生成三维样本的三维重建结果。该方法通过增加一路采集光路，实现在同等迭代次数下，增强焦面重建信噪比，光场显微成像的重建效果有很大的提升。