本发明公开了一种用于显微视觉系统的自动对焦装置及方法，该装置包括一个显微光学系统、一个数字摄像系统、一个玻片夹持装置和一个Z向运动装置。显微光学系统由显微物镜、结像透镜、聚光镜、光源组成。Z向运动装置与聚光镜相连，驱动聚光镜与显微物镜之间相互移动。Z向运动装置具有顶针，顶针与玻片紧密接触，并驱动玻片运动。数字摄像系统在玻片运动过程中对玻片上的样品区域进行显微摄像，并利用数字图像处理的方法评价图像锐利度，确定最佳焦点，实现自动对焦。本发明适用于大数值孔径显微摄像的自动对焦，并具有对焦速度快、光学分辨率稳定、对切片夹持装置平整度要求低等特点。